Nat.Commun.
一种治疗流感病*感染的通用双机制免疫疗法
大家好，今天给大家分享的一篇是今年一月发表在NatureCommunications上的文章，通讯作者是美国普杜大学的PhilipS.Low教授
鉴于年流感大流行造成的死亡人数估计超过万，并且预计未来还会爆发大流行，因此需要有效的流感治疗至关重要。在这项研究中，作者通过将神经氨酸酶抑制剂扎那米韦与具有高度免疫原性的半抗原二硝基苯基（DNP）结合来设计和合成双功能小分子，后者专门针对游离病*和病*感染细胞的表面。向感染了xMLD50病*的小鼠经鼻腔或腹膜内给予单一剂量的药物可根除甲型和乙型流感病*代表株的晚期感染。由于重症感染的治疗在致死性接种后的三天内仍然有效，因此该方法可以成功治疗目前治疗难以治愈的感染。
图1神经氨酸酶靶向抗流感治疗的双重作用机制。
在下面的研究中，作者探索了以上两种治疗方法的混合物，其中利用了广谱病*神经氨酸酶抑制剂的强抗病*活性和疫苗的强大免疫功能。利用受流感病*感染的细胞在其细胞表面表达一种或多种病*蛋白这一事实，从而将它们与相邻的健康细胞区分开（图1a）。虽然细胞表面病*神经氨酸酶具有内在的抗原性，但通过用强力的半抗原（即本例中的二硝基苯基部分；DNP）修饰它们来增强其免疫原性（图1b）。由于扎那米韦结合了甲型和乙型流感的所有已知亚型/谱系的神经氨酸酶，因此不使用功能上惰性的配体来靶向该半抗原，而是提供了与有效神经氨酸酶抑制剂扎那米韦（图1c）相连的DNP部分。由于几乎所有人类都天然表达抗DNP抗体，因此产生的扎那米韦-DNP共轭物（zan-DNP）不仅可以阻断必需病*酶的活性，还可以募集免疫系统来攻击病*或感染了病*的细胞。
zan-DNP对神经氨酸苷酶具有很高的结合亲和力。扎那米韦-神经氨酸酶复合物的晶体结构所示（图2a），扎那米韦的C-7羟基暴露于溶剂中并可与免疫原性半抗原连接。基于此，作者通过与PEG相关的接头将二硝基苯基半抗原（用于治疗目的）或若丹明（用于结合测定）连接至C-7羟基（分别为图1c和图2b）。如图2c的结合曲线所示，扎那米韦-若丹明缀合物（zan-rhodamine）与A型流感病*的1组神经氨酸酶（N1）缔合，解离常数为4.9nM。此外，使用相同的若丹明标记的扎那米韦缀合物定量测定扎那米韦和zan-DNP与甲型流感病*2组神经氨酸酶（N2）结合，分别为1.0nM和1.1nM的结合常数（图2d）。zan-DNP的结合亲和力也在两种B型流感病*中进行了测试（图2e，f）。尽管DNP与扎那米韦的连接使该结合物对B型流感病*神经氨酸酶的结合亲和力比扎那米韦低约8至10倍，但结合亲和力仍保持在低纳摩尔范围内。
图2zan-DNP对病*神经氨酸酶的结合亲和力和特异性。
zan-DNP募集抗DNP抗体以感染病*。作者用免疫原性半抗原修饰了病*/感染了病*的细胞，该半抗原可以将抗半抗原抗体募集到病*颗粒/感染细胞的表面。
图3zan-DNP诱导的神经氨酸酶表达细胞的抗DNP抗体募集，补体依赖性细胞*性（CDC）和抗体依赖性细胞*性（ADCC）。
为了评估zan-DNP向病*感染的细胞募集抗DNP抗体的能力，首先采用了生物素化的抗DNP抗体以使抗体在病*感染的MDCK细胞上可视化。如图3a的共聚焦显微照片所示，抗DNP抗体仅与已经感染了甲型H1N1流感病*然后用zan-DNP处理过的MDCK细胞结合。如图3b所示，随着培养基中zan-DNP浓度的增加，抗DNP抗体与被感染的MDCK细胞的结合稳定增加，直到所有zan-DNP位点最终饱和。
抗DNP抗体与甲型流感病*（H3N2）的第2组神经氨酸酶代表成员的结合产生了非常相似的结果（图3c）。因此，结合完全取决于zan-DNP，抗DNP抗体和链霉亲和素-PE的存在，并且可以通过用过量的扎那米韦阻断神经氨酸酶位点来定量地防止结合。类似地，根据zan-DNP浓度对抗DNP抗体结合的分析表明，饱和结合取决于zan-DNP与感染的MDCK细胞的结合（图3d）。
zan-DNP介导CDC和ADCC。用甲型流感病*的N1神经氨酸酶转导HEK细胞，然后与zan-DNP加上抗DNP抗体和补体蛋白一起孵育。如图3f所示，表达神经氨酸酶的补体介导的杀死取决于病*神经氨酸酶。重要的是，在仅10nM的zan-DNP浓度下观察到最大的细胞死亡，强调了这种免疫作用对病*消除的效力。
其次，为了研究zan-DNP结合是否可能介导抗体依赖性细胞*性（ADCC），将N1转导的HEK细胞与人抗DNP抗体以及经过工程改造以诱导参与萤火虫荧光素酶表达的Jurkat细胞一起孵育。如图3g所示，当（i）用倍过量的扎那米韦阻断zan-DNP结合时（蓝线），（ii）从反应混合物中删除了抗DNP抗体（绿线）时，未观察到ADCC。或（iii）将未用N1神经氨酸酶转导的HEK细胞用作靶细胞（黑线）。这些数据与CDC上的数据一起证明zan-DNP可以通过多种机制促进感染流感病*的细胞杀伤，从而可能治愈该疾病。重要的是，图3g所示的钟形响应曲线是可以预见的，因为高浓度的zan-DNP将在桥接功能达到饱和后抑制抗体结合。
在体内测试时，zan-DNP优于zanamivir。给BALB/c小鼠接种了DNP疫苗，然后在鼻内（IN）接种致死剂量的病*。每天的体重测量结果表明，这些严重感染的小鼠在感染后2天开始减轻体重，并继续减轻体重，直到由于感染后6天体重减轻而强制实施安乐死（图4a，左图）。为了探索扎那米韦（Relenza）治疗这种严重感染的能力，如图4a所示，从感染后24小时开始，每天用0.5mol/kg扎那米韦治疗小鼠两次，对体重减轻的影响很小，对总体存活率的影响很小（蓝线），即不能有效地逆转致命的病*感染。同样，IN注射的非靶向DNP不能抵抗感染引起的体重减轻或小鼠快速死亡（橙色线）。相比之下，接种DNP疫苗并用zan-DNP治疗IN的小鼠可以从相同致死剂量的流感病*中完全恢复，这可以通过预防病*引起的体重减轻和病*引起的死亡来预防（红线）。观察到的事实证明，这种保护作用大部分是免疫介导的，因为未能对DNP接种小鼠使保护作用消失了（紫色）。
图4zan-DNP在保护小鼠免于致命的流感病*感染中的治疗功效。
为了研究zan-DNP是否可能更有效地治疗晚期感染，如上所述，对接种了致死剂量的病*的小鼠进行了0.5mol/kgzan-DNP的IN处理。只有在病*接种后48、72或96小时才开始治疗。如图4b所示，在感染后48h首先治疗的队列中，病*诱导的体重减轻最小，但在72h和96h队列中更为明显。此外，第48小时队列的动物中有％和第72小时队列的动物中有80％幸免于感染。相反，对扎那米韦治疗的小鼠进行的相同研究显示，在48小时队列中体重减轻不受阻碍。与图4a相似，这些数据还证明zan-DNP比游离的zanamivir更有效地治疗A型流感（H1N1）病*感染。此外，如图4c所示，即使所有单独使用zanamivir的小鼠都死于感染，单剂量的zan-DNP也能够预防多种A型和B型流感病*感染小鼠的死亡。
zan-DNP的肠胃外给药同样有效。有些患者不能使用吸入的神经酰胺酶抑制剂，对于这些患者，扎那米韦的静脉内（IV）制剂最近被证明是高度有益的。为了确定经肠胃外给药是否也可以有类似的结果，作者首先制备了扎那米韦-螯合物（图5a）。缀合物与流感病*感染的细胞缔合，其表观Kd=15.1nM（图5b）。如图5c所示，在构成流感病*所在的主要器官的肺部（红色条）中发现了每克组织最高的注射剂量百分比，这种摄取完全是病*神经氨酸酶特异性的（蓝色条形）。
图5zan-DNP的肠胃外给药特性的检查。
接下来，要探讨是否可以通过单次肠胃外剂量的zan-DNP挽救接种了常规致死剂量的流感病*的小鼠，如图5e所示，用未经修饰的扎那米韦治疗的所有小鼠在接种病*后7天内死亡，而即使用最低浓度的zan-DNP治疗的小鼠也全部存活。
体内外源抗DNP抗体的功效分析。最后，由于某些流感病*患者的天然DNP抗体效价可能太低而无法达到治疗效果，因此我们选择评估是否同时注射外源性抗DNP抗体可以成功地替代内源性抗DNP抗体，介导有效的抗流感免疫反应。如图6a所示，所有三剂外源性抗DNP抗体均可介导病*感染小鼠的体重减轻和完全应答，从而实现完全恢复。如所预期的，在存在外源抗DNP抗体的情况下，在所有病*感染的小鼠中，zan-DNP但未修饰的扎那米韦不能产生完全应答（图6b）。这些数据表明，在介导流感病*感染的zan-DNP疗法中，可以利用外源抗体的注射来补偿内源抗体的任何不足。
图6zan-DNP加外源性抗DNP抗体的共同给药在保护未免疫的小鼠免于致命的流感病*感染中的治疗效果。
最后，已经探索了用于杀死病理细胞的配体-半抗原靶向治疗策略，以治疗许多其他疾病。尽管在这些研究中叶酸替代了扎那米韦，而荧光素替代了DNP，在动物研究中已完全根除肿瘤。也许受到这些数据的鼓舞，随后开发了针对半抗原的免疫疗法，用于治疗黑色素瘤和前列腺癌，两种情况下在动物模型中均报告了非常有希望的数据。最近，已经开发了相关的靶向配体的半抗原疗法来杀死HIV，细菌和真菌感染的细胞。综上所述，来自多个实验室的这些一致的数据表明，用强免疫原性半抗原修饰致病细胞可以介导消灭多种疾病中的致病细胞。
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